1. Rekiperasyon selilè
Apre yo fin retire selil yo kriyoprezève nan nitwojèn likid la, yo te dekonjle ak souke konstan nan yon beny dlo 37 degre. Transfere selil yo dekonjle nan yon tib santrifujeur, ajoute medyòm konplè DMEM pre-chofe nan 37 degre (nan ki serom fetis bovine se apeprè 10 pousan), dousman kònen respire, santrifuje nan 500 g pou 2 min, epi jete supernatant la.
Ajoute mwayen konplè DMEM pou lave epi jete supernatant la. Ajoute medyòm konplè DMEM, melanje dousman pa pipete, fè yon sispansyon selil, inokulasyon li nan yon plat Petri/flakon, ak kiltive nan yon enkibatè selil ki gen 5 pousan CO2.
2. Pasaj selilè
Lè dansite selil la rive nan 80 pousan ~ 90 pousan (rendeman twò bonè se ensifizan, selil twò ta yo nan move kondisyon, subculture nan yon rapò 1:2 a 1:10 oswa plis, jeneralman 1:3 a 1:5 jenerasyon selilè, sa vle di, nan inokulasyon selilè Nan moman separasyon ak re-kiltivasyon, yo te retire mwayen konplè a epi lave de fwa ak 1X PBS.
Ajoute trypsin (nòt: kantite solisyon dijesyon ki pi bon pou kouvri selil yo, ak tanperati dijesyon pi bon an se 37 degre. Obsève selil yo anba yon mikwoskòp: obsève selil yo dijere anba yon mikwoskòp Envèse, si sitoplasm la retracte, selil yo. yo pa konekte ansanm ankò. Tranch, ki endike ke selil yo byen dijere nan moman sa a), dijere yo, epi mete yo nan yon enkibatè selil pou apeprè 2-3 minit.
Ajoute yon kantite apwopriye nan mwayen DMEM konplè pou sispann tripsinizasyon, transfere nan yon tib santrifujeur ak santrifuje nan 500 g pou 2 minit, jete supernatant la, ajoute mwayen DMEM konplè pou lave, epi jete supernatant la.
Ajoute mwayen DMEM konplè, melanje pipète dousman, pipete 10 mikrolit pou konte, epi kontinye kiltive nan yon enkibatè selil ki gen 5 pousan CO2 selon volim selil ki nesesè yo.
3. Cryopreservation selilè
Lè dansite selil la rive nan 80 pousan ~ 90 pousan, retire mwayen konplè a epi lave 2 fwa ak 1X PBS. Ajoute tripsin pou dijesyon epi mete yo nan yon enkibatè selil pou apeprè 2-3 min. Ajoute mwayen DMEM konplè pou sispann dijesyon trypsin, transfere nan yon tib santrifujeur ak santrifuje nan 500 g pou 2 minit, jete supernatant la, ajoute mwayen DMEM konplè pou lave, epi jete supernatant la. Ajoute 1ml solisyon konjelasyon (90 pousan serom fetis bovin, 10 pousan DMSO. Anjeneral, kontni serik la ka ajiste ant 10 pousan ak 90 pousan. Ajoute serom nan solisyon konjelasyon an ka bay eleman nitritif pou selil yo sou yon bò, epi li kapab Bay sibstans ki pa pèmeyab pwoteksyon pandan cryopreservation selilè, tankou sikwoz, albumin, elatriye pou pi byen pwoteje selil yo), mete l nan yon tib kriyoprezèvasyon (gen alkòl izopropil nan tib la pou asire vitès rediksyon tanperati a), mete l imedyatman. Jele nan yon frijidè 4 degre pou 30 minit, epi mete l nan yon frijidè -20 degre pou 30 minit, epi mete l nan yon frijidè -80 degre lannwit lan.
Mete l nan azòt likid jou kap vini an, li ka estoke pou omwen de ane, epi si ou pa mete l nan azòt likid, li ka estoke pou twa mwa.
Prensip kriyoprezèvasyon selil ak rekiperasyon an se: konjelasyon dousman ak dekonjle, ki pi fezab pou kenbe viabilite selil yo. Cryopreservation nan selil san okenn ajan pwoteksyon ap mennen nan pwodiksyon an nan kristal glas intraselilè, ki pral lakòz andojèn domaj mekanik nan selil yo, lakòz chanjman nan anviwònman intraselilè presyon osmotik, pH, elektwolit, elatriye, ak Lè sa a, ankouraje lanmò selil.
4. Zafè ki bezwen atansyon
(1) Prechofe solisyon kilti a: mete boutèy la prepare ki gen solisyon kilti a, PBS ak tripsin nan yon beny dlo 37 degre pou chofe;
(2) Sèvi ak 75 pousan alkòl pou siye ultra-pwòp tab travay la ak men ki te iradyasyon ak reyon iltravyolèt;
(3) Plasman kòrèk enstriman yo itilize: asire ase espas opere, ki pa sèlman fasil pou opere, men tou diminye polisyon;
(4) Limen lanp alkòl la: sonje ke flanm dife a pa ta dwe twò piti;
(5) Operasyon aseptik strik;
(6) Dijesyon modere nan selil aderan yo: Tan dijesyon an afekte pa anpil faktè tankou kalite solisyon dijesyon, tan preparasyon, ak kantite lajan an ajoute nan flakon kilti a. Pandan pwosesis dijesyon an, yo ta dwe peye atansyon sou chanjman ki fèt nan fòm selil kiltive yo. Yon fwa sitoplasm la retresi, Si koneksyon an vin lach, oswa gen siy k ap flote an moso, dijesyon an ta dwe sispann imedyatman;
(7) Tout operasyon sou selil pasaj yo ta dwe pi pre flanm dife yon lanp alkòl ke posib. Li pi bon pou travay ak yon sèl selil nan yon moman, lè l sèvi avèk yon seri ekipman pou chak selil. evite enfeksyon kwa;
(8) Bouch boutèy la nan selil pasaj la bezwen esterilize sou yon lanp alkòl chak fwa li louvri oswa fèmen.
