Lè w jis gradye epi w antre nan travay la, w ap fè fas ak yon pakèt non k ap fè fas ak eksperyans PCR quantitative an tan reyèl. Èske ou konfonn sou ki kote yo kòmanse? Ki sa ki siyifikasyon koub anplifikasyon, koub estanda, papòt, valè CT, koub k ap fonn ak debaz? Imaj fliyoresan ki soti nan eksperyans sa yo twò klere, men mwen pa ka idantifye yo. Jodi a, nou pral mennen w aprann konesans ak konsèp sa yo nan de pati: tèm teknik ak kesyon yo poze souvan.
Pati I Kondisyon Pwofesyonèl
1. koub anplifikasyon
Koub anplifikasyon an refere a koub la kote nimewo sik la se absis la ak entansite fluoresans an tan reyèl pandan reyaksyon an se òdone pandan PCR la.
2. Debaz
Baseline refere a ti chanjman nan siyal fliyoresan pandan premye sik yo nan yon reyaksyon anplifikasyon PCR. Nivo siyal la montre tou pre yon liy dwat, ki se liy debaz la.
3. Anviwònman papòt fluoresans
Tipikman, siyal fluoresans nan 15 premye sik reyaksyon PCR yo itilize kòm siyal fliyoresan background, ak papòt fluoresans la se 10 fwa devyasyon estanda siyal fluoresans la pandan 3-15 sik PCR, ak papòt fluoresans la. se mete pandan faz eksponansyèl anplifikasyon PCR la. Tipikman, chak enstriman gen papòt fliyoresans li anvan ou itilize.
4. CT valè
Valè CT a reprezante kantite sik ki pral rive pou chak tib reyaksyon PCR lè siyal fliyoresan an rive nan papòt fikse a. Soti nan rechèch, nou konnen ke gen yon relasyon lineyè ant valè CT nan chak modèl ak logaritm nan nimewo a kopi kòmanse nan modèl sa a. Plis nimewo kopi inisyal la pi wo, se pi piti valè CT a, ak vis vèrsa. Sèvi ak estanda ak nimewo kopi kòmanse li te ye, yo ka fè yon koub kalibrasyon kote abscis la reprezante logaritm nimewo kopi kòmanse a, pandan y ap òdone a reprezante valè CT a. Se poutèt sa, osi lontan ke valè CT echantiyon enkoni a jwenn, nimewo kopi inisyal echantiyon an ka kalkile nan koub estanda a.
konnen plis
Gen plizyè endikatè pou jije si koub anplifikasyon an bon oswa ou pa:
Repons: Pwen enfleksyon koub la evidan, espesyalman faz eksponansyèl echantiyon fraksyon ki ba-lou evidan, paralelis an jeneral nan koub anplifikasyon an trè bon, debaz la plat, pa gen okenn fenomèn k ap monte, ak anplifikasyon an. koub echantiyon konsantrasyon faz eksponansyèl ba-nivo a trè bon. evidan.
B: pant nan faz eksponansyèl koub la dirèkteman pwopòsyonèl ak efikasite anplifikasyon, pi gwo pant lan, se pi wo efikasite anplifikasyon.
C: Liy debaz estanda a plat oswa yon ti kras diminye, san okenn tandans aparan anwo.
D: Paralelism koub anplifikasyon yo pou chak tib se yon bon bagay, ki endike ke efikasite anplifikasyon chak tib reyaksyon se menm jan an.
5. K ap fonn koub
Lè pwodwi PCR la chofe, kòm tanperati a monte, pwodwi anplifikasyon doub-chache a piti piti dissociation, sa ki lakòz yon diminisyon nan entansite fliyoresans. Lè yo rive nan yon sèten tanperati, yon gwo kantite pwodwi separe, sa ki lakòz yon diminisyon byen file nan fliyoresans. Sèvi ak fonksyon sa a ansanm ak diferan valè TM pou diferan pwodwi PCR tou diferan nan tanperati a nan ki siyal la fliyoresan rapidman diminye, ki ka yon bon fason yo idantifye espesifik PCR.
6. Koub k ap fonn (lè l sèvi avèk koub logaritmik)
Grafik pik la fòme pa logaritm koub k ap fonn pou montre sitiyasyon fragman pwodwi yo plis entwisyon. Depi tanperati k ap fonn lan se valè TM yon fragman ADN, yo ka detèmine sèten paramèt ki afekte valè TM nan yon fragman ADN, tankou gwosè fragman, kontni GC, elatriye. Anjeneral, dapre prensip konsepsyon primè nou an, anjeneral li di. ke longè pwodwi anplifye a se nan seri a nan 80-300bp, ak tanperati a k ap fonn yo ta dwe ant 80 degre ak 90 degre.
A: Si gen sèlman yon pik prensipal ant 80 degre ak 90 degre, sa vle di ke PCR an tan reyèl pafè.
B: Si pik prensipal la parèt ant 80 degre ak 90 degre, ak pik enpurte a parèt anba a 80 degre, yo fondamantalman konsidere kòm primè-dimè. Sa a se yon bon opsyon pou eseye rezoud pa ogmante tanperati a recuit.
C: Si pik prensipal la parèt ant 80 degre ak 90 degre, ak yon pik pèdi wout parèt lè tanperati a ogmante, kontaminasyon ADN fondamantalman konsidere. Ak ADN a bezwen retire nan premye etap yo nan eksperyans la.
7. Liy koub estanda
Estanda estanda yo te dilye nan diferan konsantrasyon epi yo te itilize kòm modèl pou reyaksyon PCR. Koub estanda a trase ak logaritm nimewo kopi estanda kòm absis la ak valè CT mezire kòm òdone. Lè yo quantifier yon echantiyon enkoni, yo ka jwenn nimewo kopi echantiyon an nan koub estanda a ki baze sou valè CT echantiyon enkoni a. Koub estanda yo trè enpòtan pou quantification absoli.
dezyèm pati a. pwoblèm komen
Q1: Ki diferans ki genyen ant RT-PCR, QPCR, PCR an tan reyèl ak RT-PCR an tan reyèl?
A1: RT-PCR se PCR transcription ranvèse, ki se yon varyant lajman itilize nan reyaksyon chèn polymerase. Nan RT-PCR, seksyon RNA a transkri nan ranvèse nan ADN konplemantè, ki Lè sa a, itilize kòm yon modèl pou PCR anplifye ADN nan pa PCR.
PCR an tan reyèl ak QPCR se menm bagay la, tou de se PCR quantitative an tan reyèl, ki vle di ke gen anrejistreman an tan reyèl nan done nan chak sik pandan pwosesis PCR la. Nan fason sa a, kantite modèl demaraj ka jisteman analize.
Malgre ke tou de PCR an tan reyèl ak PCR ranvèse-transkripsyon parèt yo dwe abreje kòm RT-PCR, konvansyon entènasyonal la se ke RT-PCR refere espesyalman a PCR ranvèse-transcription, pandan y ap PCR an tan reyèl souvan abreje kòm qPCR (Quantitative Real- True Real-True Real PCR) - tan PCR).
RT-PCR an tan reyèl (RT-QPCR) se yon kalite PCR ranvèse transcription ki konbine teknik quantitative fliyoresan: premye transcription ranvèse soti nan RNA pou jwenn cDNA (RT), ki te swiv pa analiz quantitative lè l sèvi avèk PCR an tan reyèl (QPCR).
Q2: Poukisa longè fragman pwodwi anplifye nan PCR quantitative fluoresan kontwole nan ranje 80-300bp?
A2: Longè chak sekans jèn diferan, kèk nan yo se plizyè Kb ak dè santèn de BP. Sepandan, lè nou desine Jadendanfan an, nou sèlman bezwen mande pou longè pwodwi a 80-300bp, epi twò kout oswa twò long pa apwopriye pou deteksyon PCR quantitative.
Fragman pwodwi yo twò kout pou yo ka distenge ak primè-dimè. Longè primè-dimè a se apeprè 30-40bp, lè li se mwens pase 80bp, li difisil pou distenge si li se yon premye-dimè oswa yon pwodwi. Si fragman pwodwi a twò lontan, depase 300bp, li pral fasilman mennen nan efikasite anplifikasyon ki ba, epi kantite jèn pa ka efektivman detekte.
Pa egzanp, lè ou konte kantite moun ki nan yon salklas, ou bezwen sèlman konte konbyen bouch ki genyen. Menm bagay la tou vre lè tès jèn yo. Ou bezwen sèlman detekte yon sèten sekans yon jèn pou reprezante tout sekans lan. Li fasil pou fè yon erè si w ap konte tou de bouch ak nen, zòrèy, ak linèt pou konte moun.
Q3: Ki longè pi bon pou konsepsyon Jadendanfan an?
A3: Anjeneral pale, longè primè nan seri 20-24bp yo bon. Natirèlman, nou dwe peye atansyon sou valè TM nan Jadendanfan a lè w ap desine Jadendanfan an, paske li gen rapò ak tanperati a rkwir optimal. Apre yon anpil nan eksperyans, li te pwouve ke 60 degre se yon bon valè TM. Tanperati rkwit ki ba ka fasilman mennen nan anplifikasyon ki pa espesifik, pandan y ap tanperati rkwit segondè anjeneral mennen nan efikasite anplifikasyon ki ba, pik an reta nan koub anplifikasyon ak reta valè CT.
Kesyon 4: Èske kantite echantiyon yo kolekte afekte rezilta eksperimantal yo?
A4: Non. Li evidan, plis echantiyon yo kolekte, plis RNA ekstrè, plis cDNA a, ak plis fragman sib pral genyen. Pou quantification absoli, li nesesè pou kalkile nimewo kopi fragman sib la, ak kantite echantiyon yo kolekte pral definitivman afekte rezilta eksperimantal yo. Pou egzanp, deteksyon an nan viris epatit C HBV nan san an se detekte kontni an HBV nan yon sèten kantite (1ml) nan san.
Pou quantifikasyon relatif ki souvan itilize nan rechèch syantifik, kantite echantiyon yo pa gen anyen fè ak rezilta eksperimantal yo, paske quantification relatif refere a konparezon ant jèn sib la ak jèn referans la. Jis tanpri konsidere yo kòm fragman en ak en prezan nan menm strand asid nikleyik la. Si gwosè echantiyon an gwo, tou de referans ak jèn sib yo ogmante nan pwopòsyon egal an menm tan an, ki pa afekte rezilta yo.
Q5: Èske efikasite transkriptaz ranvèse afekte rezilta eksperimantal yo?
A5: Menm jan ak pi wo a. Remake byen ke nou vle pi wo efikasite RT, men nou prefere ke anzim RT a relativman ki estab epi jwenn rezilta inifòm. Sa a pral yon tès nan kapasite yo optimize nan swit transcription ranvèse gwo konpayi yo.
Kesyon 6: Èske efikasite nan anzim TAQ afekte rezilta eksperimantal yo?
A6: Efikasite TAQ anzim relativman gwo. Tipikman, anzim taq cho-start yo obligatwa epi yo relativman efikas. Pou twous komèsyal fluoresans quantitative, chak manifakti pral optimize efikasite nan pi bon eta a dapre pwòp pwodwi yo tou pre 100 pousan, si efikasite a twò ba, rezilta eksperimantal yo pa ka jwenn. Pou pwodwi diferan konpayi yo, sa a se yon mezi bon jan kalite.
Kesyon 7: Èske kantite lank fliyoresan afekte rezilta eksperimantal yo?
A7: Wi, li pral. Si fluorochrome a twò satire, li ka lakòz entèferans bri nan kèk enstriman. Si fluorochrome a pa satire, ak valè fluoresans la twò ba, li pral antre nan yon faz plato byen bonè ak koub anplifikasyon an pral plat. Nan eksperyans nan fliyoresan quantitative, valè CT a sitou wè, kidonk li pa enpòtan pou koub anplifikasyon an reta antre nan etap plato a, men foto a pa bèl ase. Si ou te oblije chwazi, kòmanse pa chwazi yon fluorochrome ki se yon ti kras mwens satire. Sepandan, lè w ap itilize menm pwodwi ki soti nan menm konpayi an, efè li se fondamantalman neglijab.
Kesyon 8: Èske transmisyon tib PCR la ap afekte rezilta eksperimantal yo?
A8: Wi. Sepandan, pou menm pakèt consommables nan menm manifakti a, efè sa a ka inyore. Sa a se yon bon chwa epi li pi bon yo sèvi ak yon plak 96-byen ak yon manbràn pèmeyabilite segondè pou minimize efè a nan transmissions limyè nan consommables yo.
Q9: Èske erè pandan operasyon afekte rezilta eksperimantal yo?
A9: Enfliyans pwosesis operasyon an sitou reflete nan inifòmite a. Omojèn vle di ke tout konpozan nan sistèm nan yo respire melanje ansanm, ak santrifujasyon flash ka rezoud pwoblèm sa a. Anplis de sa, pou débutan, li pi bon pou ajiste sistèm PCR la pou plis pase 20 pous, epi yon sistèm ki twò piti gen plis tandans fè erè. Si tanperati a annealing optimize kòrèkteman, efè konsantrasyon Jadendanfan sou CT minimize. Epi ou pral konnen ke kèk erè operasyonèl (tankou konsantrasyon Jadendanfan) ka evite pa optimize tanperati a annealing.
Rezime
Pi wo a se kèk kesyon ak kesyon ke inisyasyon souvan rankontre pandan eksperyans la, nou espere kesyon sa yo ka ede w rezoud kèk konfizyon. Eksperyans se pwosesis pou kreye dezòd ak rezoud pwoblèm, èspere ke ou jwenn yon bagay soti nan li. Mèsi pou lekti epi nou pral wè ou pwochen fwa!
